鸡心乳酸脱氢酶（L-LDH）

一、产品介绍

二、乳酸底物法测定酶活

2.1 测定原理

在强碱性条件下，鸡心L-LDH催化L-乳酸与NAD⁺反应生成丙酮酸和NADH。在一定范围内NADH的生成速率与L-LDH活力成正比。在340nm处测定NADH的生成速率，根据酶活计算公式即可测出酶活力。1个酶活单位（U）等于在下述反应条件下每分钟生成1微摩尔NADH所需的酶量。

2.2   检测方法

1.     酶稀释液：50mM PB-K，1mg/ml BSA，0.1% NaN3，pH7.0。过0.22um滤膜后2-8℃保存，保质期1年。

2.     Buffer：350mM CAPS（Mr=221.32），0.1% NaN3，pH10.0 (25℃)，过0.22um滤膜后2-8℃保存，保质期一个月。

3.     R1：1M 乳酸锂，0.1% NaN3。过0.22um滤膜后2-8℃保存，保质期一个月。

4.     R2：9mM NAD ，0.1% NaN3。过0.22um滤膜后2-8℃保存，保质期为一周。

1.     R：临用前按Buffer : R1 : R2=920ul : 80ul : 200ul比例混合，2-8℃保存，保质期1天。用前恢复室温。

2.     待测酶液S：称量所需的酶粉，用去离子水或50mM PB-K (pH 7.0)复溶，定容到既定体积配制成待测酶液S。用酶稀释液将其稀释至200-2000U/L内的2-5个梯度。

3.     酶活检测步骤

1）   将1200ul的R添加至“d=1.0cm”的石英比色皿中，37℃温育1min；然后加入20ul待测酶液 S，充分混匀后，37℃反应至3min；记录第2-3min内OD₃₄₀的变化，并计算每分钟吸光值变化率（△As/min）。测活历程如下：

2）   重复以上步骤，用20μl酶稀释液作为阴性对照。记录空白吸光值（△Ab/min）。

1.     计算公式

2.3 酶性质附图（乳酸底物法）

三、丙酮酸底物法测定酶活                

3.1  测定原理

在中性偏碱条件下，鸡心L-LDH催化丙酮酸和NADH反应生成L-乳酸与NAD⁺。在一定范围内NADH的消耗速率与L-LDH活力成正比。在340nm处测定NADH的消耗速率，根据酶活计算公式即可测出酶活力。1个酶活单位（U）等于在下述反应条件下每分钟消耗1微摩尔 NADH所需的酶量。

3.1  检测方法

1.     Buffer：100mM PB-K，pH7.0。

2.     酶稀释液：50mM PB-K，1mg/ml BSA，0.1%NaN3，pH7.0。过0.22um滤膜后2-8℃保存，保质期1年。

3.     R1：100mM PB-K，25.4mM丙酮酸钠盐或钾盐，0.1%NaN3，pH7.0。过0.22um滤膜后2-8℃保存，保质期一个月。

4.     R2：10mM Tris-HCl， 10mg/ml NADH，0.1%NaN3，pH9.7，过0.22um滤膜后2-8℃保存，保质期1周。

5.     R：临用前按Buffer : R1 : R2=3000ul : 100ul : 50ul比例混合，2-8℃保存，保质期1天。用前恢复室温当OD₃₄₀<0.8时，重新配置R。若OD₃₄₀依然小于0.8，请重新配置R2。

6.     待测酶液S：称量所需的酶粉，用去离子水或50mM PB-K (pH 7.0)复溶，定容到既定体积配制成待测酶液S。用酶稀释液将其稀释至500-3000U/L范围内的2-5个梯度。

7.     酶活检测步骤

1）   将1200ul的R添加至“d=1.0cm”的石英比色皿中，37℃温育1min；然后加入20ul待测酶液 S，充分混匀后，37℃反应至3min；记录第2-3min内OD₃₄₀的变化，并计算每分钟吸光值变化率（△As/min）。测活历程如下：

2）   重复以上步骤，用20μl酶稀释液作为阴性对照。记录空白吸光值（△Ab/min）。

8.     计算公式

3.3 酶性质附图（丙酮酸底物法）