一、产品介绍
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外 观： |
白色无定形粉末 |
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蛋白比活： |
≥20,000 Kunitz units/mg protein |
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纯 度： |
不含RNase、蛋白酶、其它DNA内切酶和外切酶；≥95%(SDS-PAGE) |
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稳 定 性： |
-20℃至少稳定2年 |
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分 子 量： |
~35kD的糖蛋白 |
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等 电 点： |
6.0左右 |
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抑 制 剂： |
EDTA 、EGTA、SDS、DTT、β-巯基乙醇等还原剂 |
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激 活 剂： |
Mg2+，Mn2+，Ca2+，Co2+，Zn2+ |
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pH稳定性： |
4.0-9.0（25℃，24h） |
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最适 pH： |
6.0 |
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最适温度： |
活力随温度（20℃-60℃）升高逐渐升高；37℃测值为25℃测值的3.3倍。 |
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热稳定性： |
55℃以下稳定；60℃加热30min后活力依然保留50%以上；70℃以上失活。 |
二、酶活测定方法
1. 原理
利用DNase降解DNA生成寡核苷酸时260nm处的吸光值会升高的原理，在一定条件下，OD260每分钟的增加率与DNase的含量成正比例。以牛胸腺DNA为底物，在pH5.0、25℃条件下，1Kunitz unit能使OD260每分钟增加0.001。
2. 测活试剂
2.1 1M 醋酸钠缓冲液 (pH 5.0)：将13.6g醋酸钠溶于80ml去离子水，再用6M HCl调pH 5.0（25℃），加去离子水定容至100ml，室温保存。
2.2 100mM MgSO4：将1.2g MgSO4溶于100ml去离子水，室温保存。
2.3 0.033% (W/V)小牛胸腺DNA
1）将100mg 小牛胸腺DNA（欣经科 货号：7026）溶于300ml预冷的去离子水中，冰浴至少30min，缓慢搅拌至完全溶解。分装后，冻存于-20℃。临用前在37℃解冻。
2）测定DNA的浓度
a. 用去离子水将1.1.3底物DNA样品稀释N倍（10-30倍），以去离子水作为阴性对照。
b. 用UV分光光度仪测定OD260，以阴性对照归零。
c. 1个OD260单位相当于50μg/ml DNA，DNA浓度的计算公式如（1.1）。
2.4 酶稀释液：即0.85% NaCl（150mM）。将0.85g NaCl溶于100ml去离子水，室温保存。
2.5 反应液R
1）按下表配置50ml 反应液R。
2）轻柔混匀后，用0.1M HCl和0.1M NaOH调pH 5.0 (25ºC)。2-8℃可稳定保存至少2个月。
3）*注意：根据4.3测得的DNA浓度适当添加去离子水和底物DNA。测活试剂R中DNA的终浓度为0.004%(w/v) ，即40ug/ml，OD260吸光值为0.8。
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试 剂 |
ml |
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1M 醋酸钠(pH 5.0) |
5.0 |
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100mM MgSO4 |
2.5 |
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0.033% (W/V)小牛胸腺DNA |
6.0* (2.0mg of DNA) |
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去离子水 |
36.5* |
3. 待测样品的配制
测活前，用酶稀释液溶解重组型bpDNase I干粉后，再用酶稀释液将酶液稀释至200-500 Kuniz units/ml，按以下步骤检测酶活。
4. 酶活检测步骤
在1cm的石英比色杯中加入2.5ml 2.2.2测活试剂R，25℃条件下保温1.5min后，加0.5ml待测样品，迅速混匀，在260nm波长下读取2min内最大的吸光度变化率（ΔA260nm/min Sample）。同时以0.5ml去离子为空白对照，记录ΔA260nm/min Blank。按照以下公式计算酶活力。线性范围是400-500U/ml。3.00ml反应体系含83mM 醋酸钠缓冲液(pH5.0)，4.2mM MgSO4，25mM NaCl，33.33ug/ml小牛胸腺DNA及200-250 Kuniz units DNase I。酶活力计算公式：
Activity（Kunitz Units/ml）= (ΔA260nm/min Sample -ΔA260nm/min Blank) X (3) X D =△A/min×6000×D
0.001×0.5×1
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Vt |
反应液总体积 （3ml） |
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ε |
0.001 = ΔA 260nm per the unit definition |
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Vs |
样品体积 (0.5ml) |
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d |
比色皿光程 (1cm) |
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D |
稀释倍数 |
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△A/min |
△A/min Sample －△A/min Blank（单位：Abs/min） |
三、酶性质
IVD原料