乙酰辅酶A合成酶

一、产品介绍

二、酶活测定方法

1.     检测原理

2.     酶活定义

1个酶活单位等于在以下检测条件下1分钟内转化1微摩尔棕榈酸所需要的酶量。

3.     检测方法

3.1   酶活检测试剂配制方法

3.1.1 试剂A的配制

配制0.05M，pH 7.5的磷酸钾缓冲液。

3.1.2 试剂B的配制

在0.8升试剂A中依次加入ATP·Na₂盐0.6053克，六水氯化镁0.2033克， 0.8216克辅酶A，调整pH7.5，用试剂A定容到1升。（可按比例配制，辅酶A不稳定，可现用现加）。

3.1.3 试剂C的配制

在0.8升水中加入50克Triton X-100和2毫摩尔的棕榈酸，加热使棕榈酸完全溶解，冷却到室温，用氢氧化钠调节pH至7.5，用试剂A定容到1升。（可按比例配制）

3.1.4 试剂D的配制

在0.8升试剂A中依次加入0.1251克NEM（马来酰亚胺），0.505克4-氨基安替吡啉，8kU过氧化物酶，0.25克叠氮钠，调整pH7.5，用试剂A定容到1升。（可按比例配制）

3.1.5 试剂E的配制

在80ml试剂A中加入2克苯酚，用试剂A定容到100ml。（可按比例配制）

3.1.6试剂F的配制

ACS稀释液：在1升的pH为7.5的10毫摩尔磷酸钾缓冲液中加入2毫摩尔的ATP和1克的Triton X-100。（可按比例配制）

3.1.7 试剂G的配制

ACOD稀释液：在1升的pH7.5的25毫摩尔磷酸钾缓冲液中加入0.02毫摩尔FAD和0.2克牛血清蛋白。（可按比例配制）

3.1.8 试剂H的配制

用试剂G配制240kU/L的ACOD（乙酰辅酶A氧化酶）酶液。

3.2  待测样品的配制

检测前用卧氏称量管称量所需酶，酶称量时，应至少称量10毫克的酶，以保证称量的准确性。用酶稀释液（试剂F）溶解，定容到配制体积。   

3.2.5 酶活检测步骤

1、320μl试剂B与80μl试剂C在37℃保温1分钟。

2、加入20μl稀释好的ACS酶液，37℃反应10分钟。

3、加入800μl试剂D、20μl试剂E，37℃保温2分钟；加入20μl试剂H，37℃反应5分钟，记录吸光值（As）。

4、重复第1、2、3步骤，用20微升的ACS稀释液代替ACS酶液。记录空白吸光值（Ab）。

注意：△A=As-Ab≤0.300；此法酶的最适线性为100-200 U /L。

3.2.6 酶活力计算公式

酶活力（U/L）=  △A/min×Vt× D×1000  =△A/min×1050×D

                                    0.5×ε×Vs×d

                                酶比活力（U/mg）= 

三. 附图